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更新時間：2022-04-23
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BACTEC FX 全自動系統(tǒng)用于藥品快速無菌快速檢查的評價研究
上海市食品藥品檢驗所，國家藥品監(jiān)督管理局藥品微生物檢測技術重點實驗室，上海 201203
摘要：目的：評價 BACTEC FX 全自動系統(tǒng)用于無菌快速檢查的可行性。方法：選擇 15 種不同類型的無菌制劑，參照 2015 年版中國藥典四部藥品微生物檢驗替代方法驗證指導原則，以中國藥典無菌檢查法為參考，考察該方法的專屬性、檢測限、重復性的及耐用性。結果：專屬性試驗結果表明該系統(tǒng)適用于部分無菌制劑的無菌檢查，其中，對于丙泊在注射液，該系統(tǒng)的無菌檢查結果與藥典方法基本相當。結論：BACTEC FX 全自動系統(tǒng)用于藥品無菌檢查具有快速、靈敏度高的優(yōu)勢，有望為常規(guī)無菌檢查法帶來有效的補充。
關鍵詞：無菌檢查；CO2 檢測技術；快速檢測技術；BACTEC FX
Keywords: sterility test; CO2 detection technology; rapid microbiological method (RMM); BACTEC FX
無菌檢查法系用于檢查藥典要求無菌的藥品、生物制品、醫(yī)療器械、原料、輔料及其他品種是否無菌的一種方法[1]。無菌檢查法是最古老和成熟的微生物檢測方法之一。最早可追溯至 1932 年的英國藥典[2]，我國的第一部藥典（1953 年版）也收載了無菌檢查法。在此之后的藥典改版中，國內外藥典對于無菌檢查法進行了多次修訂，目前各國藥典[3-5]基本協(xié)調統(tǒng)一，均采用培養(yǎng)基渾濁觀察法判斷產品的無菌狀況，培養(yǎng)周期一般不少于 14 天。該方法的適用性較強，但也有一些限制，較長的培養(yǎng)周期難以應對重大藥害事件對時間的緊迫需求；依靠培養(yǎng)基渾濁觀察法受操作人員經驗影響較大，具有一定的主觀性，而且在整個檢查過程中需要反復觀察，操作繁瑣，自動化程度低，缺乏一定的可追溯性[6]。近年來，各國藥典和法規(guī)均鼓勵新技術應用于微生物領域，如聚合酶鏈式反應（PCR）技術[7]、三磷酸腺苷(ATP)發(fā)光檢測技術[8]、pH/CO2 電阻檢測[9-11]等，這些快速微生物檢測技術有效的提升了藥品微生物的檢出效率。
BACTEC FX 全自動系統(tǒng)是基于微生物生長原理，培養(yǎng)瓶內的各種營養(yǎng)物質可提供微生物生長的物質基礎，而微生物生長過程中的代謝產物之一 CO2 將激活瓶內底部熒光感應物質而發(fā)出熒光，熒光信號變化與 CO2 變化成正比。儀器瓶位內的探測器探測到該熒光信號的變化并經一系列運算公式的運算，得出熒光信號變化的各種參數，從而判斷培養(yǎng)瓶內是否有微生物生長。該系統(tǒng)目前在臨床領域應用較為廣泛[12]，也有用于無菌樣品的檢測的報道[13-14]。
本研究選擇了 15 種典型的無菌制劑，參照 2015 年及 2020 年版中國藥典四部通則<9201>藥品微生物檢驗替代方法驗證指導原則的有關內容，對 BACTEC FX 全自動系統(tǒng)與中國藥典的無菌檢查法進行了系統(tǒng)比較。同時選取特定品種，全面評估 BACTEC FX 全自動系統(tǒng)與中國藥典的無菌檢查法在專屬性、檢測限、重復性以及耐用性是否存在差異。為該品種是否能采用 BACTEC FX 全自動系統(tǒng)進行無菌快速檢測提供依據。
1 儀器與材料
1.1 試驗儀器
BACTECTM FX40 全自動系統(tǒng)（美國，BD 公司）。
1.2 試驗菌株
金黃色葡萄球菌 CMCC(B)26003 、大腸埃希菌 CMCC(B)44102 、銅綠假單胞菌
CMCC(B)10104、生孢梭菌 CMCC(B)64941、枯草芽孢桿菌 CMCC(B)63501、白色念珠菌
CMCC(F)98001、黑曲霉 CMCC(F)98003 均購于中國醫(yī)學細菌菌種保藏管理中心(CMCC)。
1.3 試驗樣品
序號 | 樣品名稱 | 規(guī)格 |
1 | 碘海醇注射液 | 100ml |
2 | 鹽酸氨溴索注射液 | 2 ml |
3 | 門冬氨酸鉀鎂注射液 | 10 ml |
4 | 丙泊注射液 | 20 ml |
5 | 依托咪酯乳狀注射液 | 10 ml |
6 | ω-3 魚油脂肪乳注射液 | 100 ml |
7 | 結構脂肪乳注射液 | 250 ml |
8 | 注射用丁二磺酸腺苷蛋氨酸 | 5ml:5g |
9 | 注射用還原型谷胱甘肽 | 0.6g |
10 | 吡諾克辛滴眼液 | 5 ml |
11 | 復方托吡卡胺滴眼液 | 10 ml |
12 | 氟米龍滴眼液 | 5 ml |
13 | 羧甲基纖維素鈉滴眼液 | 0.4 ml |
14 | 吸入用丙酸倍氯米松混懸液 | 2 ml |
15 | 注射用硫酸多黏菌素 B | 50 萬單位 |
1.4 試驗用試劑及培養(yǎng)基
硫乙醇酸鹽液體培養(yǎng)基、胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基及胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基均購自北京三藥科技開發(fā)公司。
BACTECTM Standard/10 Aerobic/F 標準需氧瓶、BACTECTM Lytic/10 Anaerobic/F 含溶血素厭氧瓶及 BACTEC ™ PLUS+ Aerobic/F 樹脂需氧瓶均購于美國 BD 公司。
2 方法
2.1 無菌檢查
藥典組：按照 2015 年版中國藥典四部通則<1101>的規(guī)定，采用薄膜過濾法，接種硫乙醇酸鹽液體培養(yǎng)基置于 32.5℃，胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基置于 22.5℃培養(yǎng) 5d，每天觀察結果。
BACTEC FX 組（FX 組）：將一定量供試品和<100cfu 試驗菌加入標準需氧瓶或厭氧瓶中混勻，直接上機檢測，溫度設置 35℃，培養(yǎng)時間為 5d，機器自動運行發(fā)現陽性后判讀并報警。
比較藥典組和 FX 組的 5d 的生長情況。
2.2 丙泊注射液無菌快速檢查的評價
2.2.1 專屬性
專屬性試驗方法同 2.1，藥典組和 FX 組每種試驗菌平行進行三次獨立試驗。
2.2.2 檢測限
藥典組和 FX 組的樣品接種方法與專屬性相同，供試品中加入＜2cfu 的試驗菌，每種試驗菌重復進行 10 次。
2.2.3 重復性
由不同的實驗人員于不同的實驗時間，在不同的實驗室，按照專屬性方法取樣和接種， 進行重復性試驗，考察方法的精密度。
2.2.4 耐用性
增加樣品的接種量至 10ml、20ml 或延遲 24 上機，其他參考專屬性試驗不變，考察 FX
組方法的耐用性。
3 結果
3.1 無菌檢查
15 個試驗樣品的無菌檢查結果表明，藥典組和 FX 組的促生長能力基本相同，FX 組對 7 株試驗菌的促生長能力普遍快于藥典組（表 1 和表 2）；但是仍有 4 個品種：鹽酸氨溴索注射液、吡諾克辛滴眼液、復方托吡卡胺滴眼液和氟米龍滴眼液出現“假陰性"的結果。將接種量由 4ml 減少至 1ml，鹽酸氨溴索注射液能在規(guī)定時間內報告陽性，而其余 3 種滴眼液仍未能消除“假陰性"（表 3）。進一步采用帶中和效果的樹脂瓶進行實驗，恢復 4ml 的接種量，四種樣品均在規(guī)定時間給出陽性結果（表 3）。
表 1 FX 組檢出時間(d/h/min)
Tab.1 Detection time of FX group(d/h/min)
序號(No .) | 樣品名稱 (sample) | 大腸埃希氏菌(Escheric hia coli) | 金黃色葡萄球菌(Staphylococ cus aureus) | 生孢梭菌(Clostridi um sporogene s) | 枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis) | 白色念珠菌(Candid a albicans ) | 黑曲霉(Aspergill us niger) | 銅綠假單胞菌(Pseudomo nas aeruginosa) |
1 | 碘海醇注射液 (Iohexol injection) | 0:08:28 | 0:13:06 | 0:11:37 | 0:09:15 | 0:14:18 | 1:23:45 | 0:15:08 |
2 | 鹽酸氨溴索注射液(Ambroxol Hydrochloride Injection) | - | 0:20:12 | 0:06:57 | 5:06:38 | 0:15:17 | - | 0:16:44 |
3 | 門冬氨酸鉀鎂注射液 （Potassium magnesium aspartate injection） | 0:08:27 | 0:14:13 | 0:12:07 | 0:09:54 | 0:14:46 | 2:02:04 | 0:15:34 |
4 | 丙泊注射液 （Propofol injection） | 0:08:36 | 0:13:48 | 0:10:35 | 0:09:43 | 0:13:54 | 2:13:33 | 0:15:04 |
5 | 依托咪酯乳狀注射液（Etomidate emulsion injection） | 0:08:16 | 0:12:27 | 0:12:55 | 0:09:02 | 0:13:54 | 3:12:53 | 0:15:34 |
6 | ω-3 魚油脂肪乳注射 液（ω-3 Fish Oil Fat Emulsion Injection） | 0:08:25 | 0:12:27 | 0:10:35 | 0:09:42 | 0:14:03 | 3:12:53 | 0:15:37 |
7 | 結構脂肪乳注射液 （Structural Fat Emulsion Injection） | 0:08:25 | 0:12:17 | 0:10:34 | 0:09:32 | 0:13:43 | 1:23:24 | 0:15:37 |
8 | 注射用丁二磺酸腺苷蛋氨酸 （Ademetionine 1,4 - Butanedisulfonate for Injection） | 1:01:13 | 0:21:06 | 4:07:04 | 0:14:11 | 0:15:42 | 2:02:12 | 0:18:47 |
9 | 注射用還原型谷胱甘肽 （Reduced Glutathione For Injection ） | 0:08:15 | 0:16:55 | 0:10:44 | 0:11:01 | 0:16:13 | 2:12:52 | 0:17:04 |
10 | 吡諾克辛滴眼液 （Pirenoxine Ophthalmic Solution） | 0:08:17 | - | 0:12:17 | - | 0:14:25 | - | 0:15:54 |
11 | 復方托吡卡胺滴眼液 （Compound Tropicamide Eye Drops） | 0:20:37 | - | - | - | 1:04:41 | - | 0:17:04 |
12 | 氟米龍滴眼液 （Fluorometholone Eye Drops） | 0:08:26 | - | 0:11:06 | - | 0:14:14 | - | 0:15:45 |
13 | 羧甲基纖維素鈉滴眼液 （Carboxymethylcell ulose Sodium Eye Drops） | 0:08:26 | 0:12:38 | 0:13:15 | 0:09:53 | 0:14:14 | 1:18:43 | 0:16:05 |
14 | 吸入用丙酸倍氯米松混懸液 （Beclomethasone dipropionate inhalation suspension） | 0:08:15 | 0:13:36 | 0:11:04 | 0:09:22 | 0:13:43 | 2:12:42 | 0:15:36 |
15 | 陰性對照 (Negative Control) | - | - | - | - | - | - | - |
16 | 陽性對照 (Positive Control) | 0:08:03 | 0:12:33 | 0:10:23 | 0:09:11 | 0:14:10 | 1:14:38 | 0:15:04 |
注：“-"表示培養(yǎng) 5 天仍未報陽性結果。
Note:"-"means that no positive results have been reported after 5 days.
表 2 藥典組檢出時間(d)
Tab.2 Detection time of pharmacopoeia group(d)
序號 (No.) | 樣品名稱 (sample) | 大腸埃希氏菌 (Escherichia coli) | 金黃色葡萄球菌 (Staphylococcus aureus) | 生孢梭菌(Clostridium sporogenes) | 枯草芽孢桿菌 (Bacillus subtilis) | 白色念珠菌 (Candida albicans) | 黑曲霉(Aspergillus niger) | 銅綠假單胞 菌 (Pseudomonas aeruginosa) |
1 | 碘海醇注射液 (Iohexol injection) | 1 | 1 | 1 | 2 | 2 | 2 | 2 |
2 | 鹽酸氨溴索注射液 (Ambroxol Hydrochloride Injection) | 1 | 1 | 1 | 2 | 2 | 2 | 2 |
3 | 門冬氨酸鉀鎂注射液 （Potassium magnesium aspartate injection） | 1 | 1 | 1 | 2 | 2 | 2 | 2 |
4 | 丙泊注射液 （Propofol injection） | 1 | 1 | 1 | 2 | 2 | 2 | 2 |
5 | 依托咪酯乳狀注射液 （Etomidate emulsion injection） | 1 | 1 | 1 | 2 | 2 | 2 | 2 |
6 | ω-3 魚油脂肪乳注射液 （ω-3 Fish Oil Fat Emulsion Injection） | 1 | 1 | 1 | 2 | 2 | 2 | 2 |
7 | 結構脂肪乳注射液 （Structural Fat Emulsion Injection） | 1 | 1 | 1 | 2 | 2 | 2 | 2 |
8 | 注射用丁二磺酸腺苷蛋氨酸 （Ademetionine 1,4 - Butanedisulfonate for Injection） | 1 | 1 | 1 | 2 | 2 | 2 | 2 |
9 | 注射用還原型谷胱甘肽 （Reduced Glutathione For Injection ） | 1 | 1 | 1 | 2 | 2 | 2 | 2 |
10 | 吡諾克辛滴眼液 （Pirenoxine Ophthalmic Solution） | 1 | 1 | 1 | 2 | 2 | 2 | 2 |
11 | 復方托吡卡胺滴眼液 （Compound Tropicamide Eye Drops） | 1 | 1 | 1 | 2 | 2 | 2 | 2 |
12 | 氟米龍滴眼液 （Fluorometholone Eye Drops） | 1 | 1 | 1 | 2 | 2 | 2 | 2 |
13 | 羧甲基纖維素鈉滴眼液 （Carboxymethylcellulose Sodium Eye Drops） | 1 | 1 | 1 | 2 | 2 | 2 | 2 |
14 | 吸入用丙酸倍氯米松混懸液（Beclomethasone dipropionate inhalation suspension） | 1 | 1 | 1 | 2 | 2 | 2 | 2 |
15 | 陰性對照 (Negative Control) | - | - | - | - | - | - | - |
16 | 陽性對照 (Positive Control) | 1 | 1 | 1 | 2 | 2 | 2 | 2 |
注：“-"表示培養(yǎng) 5 天仍未報陽性結果。
Note:"-"means that no positive results have been reported after 5 days
表 3 FX 組減少接種量或采用樹脂瓶檢出時間(d/h/min)
Tab.3 Detection time of FX group after reducing inoculation volume or changing to BACTEC ™ PLUS+ Aerobic/F medium(d/h/min)
樣品名稱 (sample) | 培養(yǎng)瓶(culture medium) | 接種量 ( inoculation volume) （ml） | 大腸埃希氏菌 (Escherichia coli) | 金黃色葡萄球菌 (Staphylococcus aureus) | 生孢梭菌(Clostridium sporogenes) | 枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis) | 黑曲霉(Aspergillus niger) |
鹽酸氨溴索注射液 (Ambroxol Hydrochloride Injection) | 標 準 瓶 (Standard) | 1 | 00:08:23 | / | / | / | 1:23:23 |
4 | 00:10:15 | / | / | / | 01:09:47 | ||
樹 脂 瓶 (PLUS+) | |||||||
吡諾克辛滴眼液 （Pirenoxine Ophthalmic Solution） | 標 準 瓶 (Standard) | 1 | / | - | / | - | - |
樹 脂 瓶 (PLUS+) | 4 | / | 01:01:44 | / | 01:15:15 | 01:10:17 | |
復 方 托 吡 卡 胺滴眼液（ Compound Tropicamide Eye Drops） | 標 準 瓶 (Standard) | 1 | / | - | 00:18:34 | - | - |
樹 脂 瓶 (PLUS+) | 4 | / | 02:03:36 | / | 01:15:15 | 01:16:46 | |
氟米龍滴眼液 （Fluorometholone Eye Drops） | 標 準 瓶 (Standard) | 1 | / | - | / | - | - |
樹 脂 瓶 (PLUS+) | 4 | / | 00:16:34 | / | 00:13:05 | 01:10:16 |
注：“-"表示培養(yǎng) 5 天仍未報陽性結果，“/"表示未進行試驗。
Note:"-"means that no positive results have been reported after 5 days,"/" means no t tested.
3.3 丙泊注射液無菌快速檢查的評價
3.3.1 專屬性試驗結果 按照 2015 年版中國藥典無菌檢查的規(guī)定，丙泊在注射液在藥典組和 FX 組的添加的 7 株菌在 5 天內均能正常生長，2 種方法的專屬性不存在差異。
3.3.2 檢測限試驗結果 采用 SPSSV13.0 fisher 確切概率法，對上述 7 株試驗菌的檢測限試驗結果分別進行統(tǒng)計分析（表 4）， 2 種方法的檢測限差異無顯著性差異。
表 4 丙泊注射液檢測限試驗結果
Tab.3 Results of detection limit of propofol injection.
試驗平 行 | 大腸埃希氏菌 (Escherichia coli) | 金黃色葡萄球菌 (Staphylococcus aureus) | 白色念珠菌(Candida albicans) | 枯草芽孢桿菌 (Bacillus subtilis) | 黑曲霉(Aspergillus niger) | 生孢梭菌(Clostridium sporogenes) | 銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa) | |
(N | 藥典組 FX | 藥典組 FX | 藥典組 FX | 藥典組 FX 組/h | 藥典組 FX | 藥典組 FX | 藥典組 FX | |
o.) | （Chp） 組 /h | （Chp） 組 /h | （Chp） 組 /h | （Chp） | （Chp） 組 /h | （Chp） 組 /h | （Chp） 組 /h | |
/d | /d | /d | /d | /d | /d | /d | ||
1 | 1 11.5 | 2 17.5 | 2 30 | 2 11.5 | 2 93.5 | 1 17 | 1 18.5 | |
2 | 1 11.5 | 2 17.5 | 2 30 | 2 11.5 | 3 93.5 | 2 18 | 1 19.5 | |
3 | 1 11.5 | 2 17.5 | 2 31.5 | 2 13 | 3 94 | - 18 | 1 19.5 | |
4 | 2 11.5 | 3 18.5 | 2 31.5 | 2 13 | 3 98.5 | - 18.5 | 2 20 | |
5 | 2 12 | - - | 2 31.5 | 2 13.5 | 3 - | - - | 2 - | |
6 | 2 12.5 | - - | 2 32.5 | 2 14 | 3 - | - - | - - | |
7 | 2 13.5 | - - | - 33 | 3 - | 4 - | - - | - - | |
8 | - 19 | - - | - 37 | - - | - - | - - | - - | |
9 | - 21 | - - | - - | - - | - - | - - | - - | |
10 | - - | - - | - - | - - | - - | - - | - - |
注：“-"表示培養(yǎng) 5 天仍未報陽性結果。
Note:"-"means that no positive results have been reported after 5 days
重復性試驗結果 在 5d 內，2 種方法的 7 株試驗菌均正常生長， FX 組的重復性與藥典組相當。
耐用性試驗結果 FX 組在接種量、上機時間發(fā)生變化的情況下，7 株試驗菌均能在 5d 內被檢出，檢查結果不受影響，方法可正常使用。
4 討論
本研究選擇了無菌制劑的代表劑型，包括注射劑和滴眼劑等，涵蓋了液體制劑和固體制劑，規(guī)格不等，選擇的樣品數量較多，同時，增加了銅綠假單胞菌作為試驗菌株，未見同類報道。由于 BACTEC FX 全自動系統(tǒng)的檢驗原理與直接檢查法基本相同，因此選擇的樣品大多為無抑菌性的樣品。試驗結果表明，BACTEC FX 系統(tǒng)并非適用于所有品種。以滴眼劑為例，3 種多劑量的滴眼液出現假陰性結果，而一次性使用的滴眼液未見異常，推測可能是多劑量的滴眼液中的防腐劑對結果造成了干擾。由于 BACTECFX 系統(tǒng)采用的是直接接種法，全組份均在培養(yǎng)基中，而藥典方法為薄膜過濾法，推測原輔料被濾過，對結果影響較小。
為了消除樣品中可能存在的抑菌成分的影響，我們選擇了具有特殊吸附性的樹脂需氧瓶，該培養(yǎng)瓶由“帶正電荷樹脂"和“多價吸附樹脂"組成，可全面吸附多種抑菌成分，樹脂孔徑也為微生物的生長提供了附著表面，更有利于微生物生長。可以在不改變接種量的基礎上，獲得準確的結果。采用標準需氧瓶結果為陰性的 4 個樣品在采用樹脂瓶后，結果均為陽性。同時，我們也采用樹脂瓶對注射用硫酸多黏菌素 B 進行了人工污染實驗（結果未列出），除添加大腸埃希氏菌的培養(yǎng)瓶未能正常生長以外，其余 6 株菌均正常生長，提示樹脂瓶無法*中和此類抗生素的抑菌性。脂肪乳類無菌產品一直是無菌檢查中的一類難點，由于樣品本身的渾濁特性，在采用常規(guī)藥典方法進行無菌檢查時，供試品管易顯渾濁，通常需要在液體培養(yǎng)基培養(yǎng)到期后進 行二次轉接培養(yǎng)進行確認，這一操作不僅增加了污染的風險而且增加了無菌檢驗周期（大于 14 天）。而采用自動化的檢測系統(tǒng)可以克服這一缺陷。系統(tǒng)自動化采集生長信號，區(qū)別于傳統(tǒng)無菌檢查的繁瑣操作、靜態(tài)培養(yǎng)以及人為的濁度判讀法，降低了無菌操作的風險， 具有結果報告的實時性、可追溯性以及避免人為干擾的優(yōu)勢。本研究從專屬性、檢測限、重復性、耐用性 4 個方面對丙泊注射液無菌快速檢查方法和藥典方法進行了比較研究。結果表明，快速方法與藥典方法基本相當。采用 BACTEC FX 全自動系統(tǒng)能有效縮短產品陽性檢出時間。當然，該系統(tǒng)也有一定的局限性，如樣品的接種量有限。在本研究中，我們適當的增加了樣品的接種體積，均能準確的給出陽性結果。對于體積較大的注射液，可通過增加接種培養(yǎng)瓶的數量以滿足檢驗要求。另外，本研究的試驗不可能覆蓋所有的微生物，不能排除對于某些微生物的促生長能力 2 種方法可能不相同。在下一步研究中，需要增加試驗菌株的種類，特別是產品生產環(huán)境微生物的考察。
綜上，選擇 BACTEC FX 全自動系統(tǒng)的作為藥品無菌快速檢查方法時，首先應考察樣品的特性，其次根據快速檢測方法及樣品的特點增加相應的菌株進行全面的評價。應用BACTEC FX 全自動系統(tǒng)作為無菌快速檢測方法，可為常規(guī)無菌檢查法帶來有效的補充。
參考文獻
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注：摘引上海藥檢所文章關于FX40在快速無菌領域的應用。
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